验证NGS临床检测性能的新方法

尽管基于NGS的临床检测越来越多，但目前定量评估一个检测性能的标准和方法却非常有限。扩增、建库以及测序过程中引入的偏差都会影响检测的灵敏性，相同的检测在不同的实验室中运行也会出现极大的变化。
 
为了评估检测的性能和可靠性，来自澳大利亚悉尼加文医学研究所（Garvan Institute of Medical Research）的研究人员开发出了一种技术，利用合成DNA跟踪标定（spike-in）来量化检测特定变异的能力。这项研究发表在《Nature Methods》上，研究人员描述了这种名为sequins的方法。
   
发表在《Nature Methods》上的另一项研究中，研究小组描述了一种基于RNA的sequins。
   
这两项研究的通讯作者、加文研究所转录组研究实验室主管Tim Mercer介绍，他的实验室一直致力于新基因的发现和lncRNA研究，希望在试验中有一个对照，帮助他们了解是否真的发现了新基因。
 
这项技术的关键在于，研究人员设计了反向的合成序列——从3’到5’方向，这种合成序列不会对目标序列的测序产生干扰。另外，研究小组还设计了一种用于spike-in reads比对的合成参考序列。
 
sequins可以被设计来代表不同的变异。例如，在一项试验中，研究人员利用一个癌症基因panel，想找到具体可操作的靶点，这种情况下可以设计合成spike-in代表这些变异，把spike-in作为对照。如果测序检测到了合成的变异，那么在真实样本中应该也能检测到同样的变异，这就为变异的检测增加了可靠性，且可排除某种变异的存在。
 
由于是镜像，sequin reads不会干扰天然的分子。因此，sequin reads只会比对到合成基因组上，而真实的reads则只会比对到参考序列上。
 
美国国家标准与技术研究院（NIST）的Marc Salit教授曾带领NIST的Genome in a Bottle（GIAB）联盟，进行NGS参考样品的设计。他说，这项前沿工作将会推动更多工具的研发，为NGS检测临床应用的可靠性和有效性提供证据。
 
Salit说，sequin方法可以作为GIAB联盟工作的补充。GIAB联盟正在开发参考基因组，通过分析与参考标准的匹配度，帮助研究人员验证其NGS方法的有效性。但这些参考样品都来自健康基因组。sequin方法的不同之处在于，spike-in可以被设计来代表疾病相关的变异。另外，GIAB参考样品只能帮助实验室验证整个方法的有效性，不能作为每次检测运行时的内参。
 
Mercer说，发表在《Nature Methods》上的这两篇文章建立了sequin方法的基本概念，下一步就是应用这种方法，解决基因组中用短读长测序技术难以分析的复杂区域。作者在文章中指出，目前即使是应用设计的sequin来处理这些复杂的区域也是非常有挑战性的。
 
Salit也表示，这个方法的缺点是，基因组中难以测序的区域同样也难以合成。目前研究人员正在努力解决这个问题。Salit和GIAB联盟想与Mercer的团队合作，研究如何在GIAB中使用这些参考样品。
 
Mercer说，除了继续研发sequin技术，他计划免费向学术界提供该方法。sequin可以应用到很多方面，包括基于肿瘤的检测、宏基因组学研究，甚至免疫研究，用来验证特定的免疫受体。如果有公司对它感兴趣，或可获得许可协议。
 
参考文献：1. Representing genetic variation with synthetic DNA standards. Nature Methods (2016) doi:10.1038/nmeth.3957

2. Spliced synthetic genes as internal controls in RNA sequencing experiments. Nature Methods (2016) doi:10.1038/nmeth.3958